RNA提取技术服务 赛尔生物（天津）
                RNA提取技术服务    赛尔生物（天津）
RNA是生命活动中基因表达过程非常重要的生物大分子，如mRNA,它携带了DNA的全部编码信息。RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northern  blot、RT-PCR、构建  cDNA文库、Gene  Chips以及体外翻译等实验，在动物细胞内，所含RNA主要是  rRNA(占80～85%)、tRNA及小分子RNA(占10～15%)和  mRNA(占1～5%)。rRNA含量最丰富，由28S、18S和5S几类组成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数mRNA在3’端都有一个Poly-A尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(Oligo  dT)层析柱从总RNA中将  mRNA分离出来。  

TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

一、  组织和细胞总RNA提取：
异硫氰酸胍法
（一）试剂准备  
1．CSB缓冲液：42mM柠檬酸钠；0.83%  N-lauryl  sarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸钠)；0.2  mM  β-巯基乙醇。  
2．变性液：异硫氰酸胍（终浓度  4  M）25g、CSB缓冲液  33ml，混合直至完全溶解，可在65℃助溶。4℃保存备用。  
3．2  M乙酸钠：pH  4.0。  
4．异丙醇  
5．无水乙醇、70%乙醇  
6．酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
7．0.1%DEPC  H2O：（因DEPC难溶  先取1ml  DEPC溶液于2ml  95%的乙醇中）再加到1000ml  ddH2O中，弃分振荡，37℃孵育过夜，15磅高压灭茵，4℃保存备用。
（二）操作步骤  
1．样品处理：
（１）培养细胞：收集细胞1-2×107，离心，500g×5min。对于贴壁培养细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重悬细胞并转移至10ml离心管中；悬浮培养细胞可直接转移离心管；离心：500g×5min；PBS洗涤3次。弃上清，置冰浴。加预冷变性液2  ml，充分摇动，使细胞裂解完全。以下操作均在冰浴中进行。
（２）组织：取1-2g组织（新鲜或-80℃及液氮中保存的组织均可）置组织匀浆器中，加入预冷的变性液12ml，在冰浴中充分匀浆。
2．加2  M乙酸钠(pH  4.0)0.2ml，混合后将溶液转移至5ml离心管中。
3．加酚：氯仿：异戊醇2.2ml，颠倒混合用力振荡10s，冰上放置10min。
4．4℃离心，12000g×20min。
5．小心吸取上层含有RNA的水相，并转移至一新的5ml离心管中。避免吸取两相之间的蛋白物质。
6．加等体积的异丙醇，置-20℃至少30min，沉淀RNA。
7．4℃离心，12000g×15min。
8．弃上清，再加变性液2ml重悬RNA沉淀物，振荡直至RNA完全溶解（必要时可65℃    水浴促溶）。
9.  加入等体积异丙醇，置-20℃  30min。
10.  4℃离心，12000g×15min。
11.  弃上清，加入70%乙醇4ml洗涤RNA沉淀。4℃离心，8000g×5min。
12.  弃上清，将沉淀晾干。
13.  加入适量DEPC  H2O溶液解RNA（65℃促溶10-15min）。
（三）注意事项：
1．所有实验过程均须避免Rnase的污染。
2．要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。
TRIzol法
TRIzol  RNA提取试剂盒是由GIBCO  BRL公司推出提取RNA的产品，其操作方便、快捷。
（一）试剂准备
1．TRIzol试剂。
2．氯仿
3．异丙醇
4．75%乙醇（DEPC  H2O配制）
5．DEPC  H2O
（二）操作步骤
1．  样品处理：
1    培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml  Trizol，混匀，
室温静置5min。
2    组织：取50-100mg组织（新鲜或-80℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管  中，加入1ml  Trizol充分匀浆，室温静置５min。
3    加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。
4    4℃离心，12000g×15min，取上清。
5    加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
6    4℃离心，12000g×10min，弃上清。
7    加入1ml  75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。
8    晾干，加入适量的DEPC  H2O溶解（65℃促溶10-15min）。
（三）注意事项
1．      样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。
2．    实验过程必须严格防止RNsae的污染。

Trizol法提取冻存组织总RNA  protocol（05-11-23）
1  于—80℃取出组织，秤重，放入盛有液氮的保温杯中。
2  将组织放入研钵，倒入少量液氮，研磨至细粉状，其间不断加入液氮。
3  按每100mg组织加入1mlTrizol，此时Trizol呈固态，继续研磨，固态变为透亮的液态，液体转移至1.5  EP中，每管1ml,  冰上静置5min。
4    每管加入200ul  -20℃预冷的氯仿，混匀，冰上静置10min。
5    4℃  top  speed  20min.
6    转移上清至新管，每管加入1-2VL  -20℃预冷的异丙醇（或1-4V  -20℃预冷的乙醇），混匀，-20℃静置  ﹥2h。
7    4℃  top  speed  30min.
8    弃上清，每管加入1ml  70%或75%酒精，弹起沉淀，4℃  top  speed  10min。
9    重复8
10  弃上清，室温晾干，用DEPC-treated的水溶解，