Western Blot服务 天津赛尔生物技术服务
天津赛尔生物  Western  Blot服务

    Western  blot技术服务  服务内容  
      1、  蛋白质抽提与定量；
      2、双向电泳  ；  
      3、转膜，封闭，孵育，显示成像。

      送样须知:为了保证  Western  blot技术服务能顺利进行，样品寄送需满足以下要求：  
        顾客提供：组织、细胞、蛋白质溶液等；一抗（如果公司抗体库里没有）。
        运输要求：干冰或液氮包装寄送，天津本地客户可收样。
        注样本应避免各类污染和反复冻融。

        Western  blot技术服务报告内容  
    1、蛋白质定量结果及电泳上样量；
    2、原始胶片、电子图片及图片分析结果；
    3、提供Western  blot完整的实验报告,包括实验步骤、使用仪器和试剂等。

一    细胞  裂解物      （100ml培养瓶～6×106cell）                        
1  弃去培养物，用PBS洗2次。
2  在5ml  PBS中重悬细胞。
3  离心，1000rpm，10分钟  或4度，14000rpm，1分钟
4  弃上清。
5  在100-200ul  RIPA  ＋  1ml  PASF  中重悬细胞pellet，终浓度1～6×107cells/ml
6  室温，14000rpm，5分钟，移去细胞碎片。
RIPA
终浓度    实验室常用浓度    量
0.1%SDS    10%SDS（100×）    5ml
1%TritonX-100    10%Triton  X-100  （10×）    50ml
1mMMgcl2    1M  Mgcl2（1000×）    0.5ml
10mMTris-Hcl（PH7.4）    1MTri-Hcl（100×）    5ml
1%  NP-40    10%NP-40（10×）    50ml
        定容至500ml
                                                                                                        
二    常温下放置样本≥30miｎ
　　上样：loading  buffer中含有2%ß-ME和8M尿素，100℃  煮沸3-5min。
　　跑胶：80-120Ｖ，1h～1.5h
5×SDS-PAGE  Loading  Buffer  (现用时加10%  ß-ME)
终浓度    实验室常用浓度    量    5×
0.005%溴酚蓝    0.5%溴酚蓝（100×）    1.25ml  (实际2.5ml)
2×25mM  Tris-Hcl（PH6.8）    1M  Tris-Hcl（20×）    6.25ml
2×2%SDS    10%SDS（2.5×）    5g    SDS
2×10%甘油    100%甘油（5×）    25ml
2×1%DTT或2%ß-ME（用时再加）    100%  ß-ME（50×）    现用现加
8M尿素（分子量60）        不加了
        定容至50ml



三  硝酸纤维素膜  8  cm×  5  cm,          滤纸  8.5×  5.5  cm

湿转稳流80-100mA  4℃过夜  或350mA  2-3小时
转膜缓冲液    Transfer  Buffer：    PH  8.3
终浓度    使用是  1×的    10×    5×
39mM甘氨酸    2.9g    29g    14.5g
48mM  Tris  Base    5.8g    58g    29g
0.037%SDS    10%SDS      3.7ml    37ml    18.5ml
20%甲醇    200ml    用前稀释，加甲醇，调节PH8.3值    
    定容至1000ml    定容至1000ml    定容至1000ml
现配时:100ml的10×母液  +  200ml的甲醇+700ml  DDW水并调PH  8.3

四  加一抗
1  Blotto：室温2小时.
2  first  Ab：8ml/胶，摇床30min～2h，37℃
3  TBST洗4次，每次5min（约15ml）
4  second  Ab：抗Rb，1：500  -  2000in  Blotto
（HRBconjugated）二抗  1：1000-5000  
  室温避光30～90min  。
5  TBST洗5次，每次5min  （约15ml）
6  再加3ml  ECL/胶，1.5ml  A液＋1.5ml  B液，室温  /  3分钟
7  曝光，可以试5sec，30sec，2min，10min，  或过夜。

用1×TBST稀释5%的脱脂奶粉并加0.02%  硫柳汞.
10×TBST（Tris-Buffered  Saline  with  Tween-20）
终浓度    实验室常用浓度    量  取
100mM  Tris  PH8.0    1M  Tris  （10×）    50ml
1.5M  Nacl    5M  （10/3×）    150ml  （直接称43.83g）
0.5%Tween-20    10%  Tween-20  （20×）    25ml
        定容至500ml


40%丙烯酰胺配方：
丙烯酰胺：甲叉  =29：1
                        =193.33g:  6.67g
定容500ml    0.45um过滤    4℃避光保存。

10×SDS-PAGE  跑胶Buffer  （Tris-甘氨酸缓冲液）  调PH  8.3

终浓度    10×    5×
250mM  Tris    Tris  Base：30.2g    15.1g
2.5M  甘氨酸    甘氨酸：188g    94g
1%  SDS    10%SDS：100ml    50ml
    定容至    1000ml    定容至1000ml

天津赛生物自产的抗体SRP07561

天津赛尔生物相关服务：  
MicroRNA相关服务  siRNA干扰  课题整体外包服务  基因克隆服务  慢病毒包装服务  腺病毒服务  稳定细胞株筛选服务  酵母双杂交服务    蛋白表达服务  抗体制备服务  DNA与蛋白相互作用研究  噬菌体展示技术服务  cDNA文库构建  干细胞研究  基金申请，标书撰写，专利申请，课题设计等  

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      1、  蛋白质抽提与定量；
      2、双向电泳  ；  
      3、转膜，封闭，孵育，显示成像。

      送样须知:为了保证2D    Western  blot技术服务能顺利进行，样品寄送需满足以下要求：  
        顾客提供：组织、细胞、蛋白质溶液等；一抗（如果公司抗体库里没有）。
        运输要求：干冰或液氮包装寄送，天津本地客户可收样。
        注样本应避免各类污染和反复冻融。

        Western  blot技术服务报告内容  
    1、蛋白质定量结果及电泳上样量；
    2、原始胶片、电子图片及图片分析结果；
    3、2D    Western  blot完整的实验报告,包括实验步骤、使用仪器和试剂等。