RNA干扰服务 赛尔生物技术公司
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天津赛尔生物的siRNA干扰服务由参与主编《RNA干扰：原理与应用》的工作人员，可以根据客户的需求，提供从siRNA设计到合成，shRNA质粒的构建，转染，病毒包装siRNA，RT-PCR及WB验证的一站式服务，让RNA干扰不再干扰您的科研。



技术背景：
RNA干扰（RNA  interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。

      
2：基于化学合成的双链siRNA，基于载体的shRNA构建，病毒系统包括慢病毒(  lentiviral  )  、逆转录病毒(  retroviral  )  和腺病毒  (  adenoviral  )  包装siRNA
3：体外通过转染或感染的方式导入siRNA
4：RT-PCR，WB检测干扰效果
　
交付内容
1：siRNA序列
2：采用质粒转染方式的，交付构建好的shRNA质粒。采用病毒系统包装siRNA的，交付含有包装shRNA序列的重组病毒。
3：RT-PCR，WB检测结果。赛尔承诺，对于一些非公开siRNA序列基因的siRNA设计的干扰效果，三条序列中至少有一条干扰效果在75%以上
4：详尽的操作步骤及实验结果
常见问题及解答
问1：怎样设计siRNA序列？
答
siRNA序列的设计一般遵照以下的步骤和原则
1．  在所选基因的启动子后  50-100个碱基自5’-端开始
2．  寻找基因序列中的23个碱基，  最好是5‘-  AA（N19）TT  -3’  （N是任何碱基）
3．  如果找不到四个以上AA（N19）TT，则用  AA（N21）补足。
4．  如果找不到四个以上AA（N21），  则用  NA（N21）补足。
5．  所选定序列中，G和C的数目的总和在总数（23）的35-55%.
6．  满足以上1-5项要求的片段数目如果不足四个，将G和C的数目的总和放宽至总数（23）的30-70%.
7．  选好上述序列后，以此确定所需合成双链RNA  oligo  的序列如下：
8．  正义序列  （N19）TT  与上述选定的23  个碱基序列中的第3-23个碱基相同
9．  反义序列的3’----5’  的序列与目标序列中的第1-21个碱基互补，  即A变成T，C变成G，  T变成A，  G变成C。
10．  将反义序列3’----5’  改写成  5’----3’.
11．  将最后所得序列中除3’-  末端的两个碱基之外的所有碱基中的T都用U来替代。  最后每三个组成一个字节，中间断开。
12．  将所选定的正义序列和反义序列与gene  bank  中已知同物种的基因序列进行比较，确定其唯一性（BLAST）
13．  上述  7-10  项可见如下例子：
假如通过1-5  项的条件选出的一段23  个碱基的序列是
5’-  AAGCTAGTCATGGCCATTGACTT  -  3’
正义序列就应该是：  5’-  GCTAGTCATGGCCATTGACTT  -  3’
反义序列就应该是:  3’-  TTCGATCAGTACCGGTAACTG  -5’
反转处理后即得：
正义序列：  5’-  GCTAGTCATGGCCATTGACTT  -  3’
反义序列：  5’-  GTCAATGGCCATGACTAGCTT  -3’
U替代T以后得到：
正义序列：  5’-  GCUAGUCAUGGCCAUUGACTT  -  3’
反义序列：  5’-  GUCAAUGGCCAUGACUAGCTT  -3’
段开字节后最后得到：
正义序列：  5’-  GCU  AGU  CAU  GGC  CAU  UGA  CTT  -  3’
反义序列：  5’-  GUC  AAU  GGC  CAU  GAC  UAG  CTT  -3’
赛尔的siRNA专家曾经参与编写《RNA干扰：原理与应用》，在siRNA设计方面非常有经验，成功的为客户设计了数百条siRNA序列。
　
问2：化学合成siRNA,编码shRNA载体构建生产siRNA，重组病毒导入siRNA,  我该采用哪种方法进行RNA干扰？
答：化学合成siRNA：操作简便，研究人员得到合成好的siRNA后，进行简单的稀释处理即可实验，但是基因抑制持续时间短，对细胞毒性较大。
编码shRNA载体构建生产siRNA：与化学合成siRNA相比：shRNA载体能够更有效阻遏相应基因的表达，可以用于稳定细胞系的建立，可以持续提供siRNA，携带GFP的载体可以用于检测转染效率。操作相对复杂，需要构建shRNA质粒。
重组病毒包装siRNA:  实验操作相对复杂，对技术要求较高，费用较高，特别适合于一些难转染的细胞系（如原代细胞，干细胞）的siRNA干扰。
所以客户要综合本实验的要求，成本等各个方面选择适合自己实验的RNA干扰方法。
　
问3：为什么我采用国外文献已经公布并且确定的siRNA序列，通过脂质体转染的方法在我的细胞系中没有得到预期的干扰效果？
答：
国外文献已经公布并且确定的siRNA序列从序列本身来说应该没有问题，可能的情况是您的细胞系是否适用于常规的转染方法，对于转染效率低于50%的细胞系，我们建议采用重组病毒包装siRNA的方法。所以您首先要通过查阅文献或做一个GFP的对照实验检测一下您细胞的转染效率。
　
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