RT-PCR试剂盒反应五要素
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- 供 应 地：河北省邢台市
- 发布公司：邢台德延科技有限公司
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- 发布日期：2023/2/7 18:38:42
- 联系人QQ：2739424786
详细说明
使用方法:
一、样品RNA的制备
、用自选方法抽提病毒样品RNA。注意：可以选用本公司生产的一管式病毒RNAout
2、或柱式病毒RNAout。
二：RT（逆转录）反应合成cDNA
.按下表配制RT反应体系（20μL体系）
2.70℃保温5分钟变性模板后立即冰浴。
3.严格按顺序加入6μLRTBuffer（含dNTP）和2μLMMLV逆转录酶（含RI），
反应终体积为20μL。
4.42℃保温60分钟。此步为RT反应。
5.70℃保温0分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，丌需要纯化。
反应五要素：
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2%2B
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：5-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至0kb的片段。
③引物碱基：G%2BC含量以40-60%为宜，G%2BC太少扩增效果不佳，G%2BC过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3＇端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3＇端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.～umol或0～00pmol，以低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
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