人表皮生长因子(EGF)酶联免疫试剂盒
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下面说下ELISA实验常遇到的问题以及解决方案。
异常
结果描述
【白板】
显色步骤结束后，酶标板所有孔均无颜色。阳性对照不显色。
原因分析
1.试剂已过效期，或不同试剂盒组分混用
2.错加、漏加试剂底物、显色剂 A或B
3.洗板及加样过程中，酶标受污染失活失去催化显色剂显色的能力
4.终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配置
5.蒸馏水有问题
对策
1.检查试剂的组分及批号，确认未过期以及所有组分均属对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用
2.严格按说明书的步骤操作，加完试剂后可观察一下液面高度是否一致，以减少漏加现象
3.确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净
4.每次配制时都应看清标签标明物质
5.确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染，与好蒸馏水比较
人表皮生长因子(EGF)酶联免疫试剂盒
显色弱、灵敏度 低
实验结束后，包括阳性对照、质控在内的所有板孔颜色均较淡。
1.试剂盒超过期， 超过有效期的产品可能会产生很弱的信号； 试剂盒没有按规定进行保存，受高温影响
2.试剂、样品用前未平衡至室温
3.加入试剂的体积和时间有误， 移 液器计量不准，吸嘴内水分太多或不清洁
4.洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力
5.孵育时间及孵育温度未达到要求 ，反应板放入培养箱时注意温度并及时调整
6.洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求；洗涤冲击力太大。浸泡时间太长
7.显色剂加量不足或顺序颠倒，或混合后加入
8.底物作用时间不够
9.蒸馏水水质有问题
对策：
1.实验前检查试剂的组分及批号，确认试剂未过期。 不要将试剂盒长时间置于常温下，按使用规定储藏。
2.从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平衡 20分钟左右。
3.确定所使用的试剂体积正确，加入时间适当。 校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快，排放应完全
4.确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净，确认配制洗液的纯化水达到要求且未受污染
5.孵育温度应控制在 37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。 保温期内不宜多开门，以免影响保温
6.严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板，减小洗涤冲击力，按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数
7.显色剂滴瓶垂直向下，持力均匀，滴速不宜过快，先加显色剂?A，后加显色剂B，不可将A、B液混合后加入
8.准确定时
9.测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响
实验结束后阴阳性对照正常，质控正常，但临床标本感觉显色较弱
1.待测标本中可能不含强阳性标本，故结果可能是正常的
2.标本加入叠氮钠作为防腐剂
人表皮生长因子(EGF)酶联免疫试剂盒
对策
1.充分离心， 3000rpm6分钟以上
2.加标本时尽量 避免交叉污染。如盛标本的试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板
3.手工洗板时前 3次注洗液后应立即弃去，后几次再设定浸泡时间，可减少交叉污染
4.疏通加液头，使洗板时每孔均注满洗液，吸液时残留量要小
5.洗板完毕拍板时用合适的吸水纸巾，不要把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍，以免交叉污染
假阳性
假阳性现象是一个现象，可参考上文 “灵敏度过高、板底高、高背景” 中的分析。这里只列举常见的原因及对策
1.计算 Cutoff值时使用的公式不正确，导致计算得出的CutOff值过低，从而导致出现假阳性
2.洗板时未能注满洗液或洗板次数、浸泡时间不够， 洗涤不充分，样 品中有其他成分残留 导致花板、跳孔，假阳性增多
3.血清标本处理不当，如未除去细胞成分、纤维蛋白原及其它干扰物可出现孔底由变蓝的跳孔现象，此标本重复实验结果往往是阴性
4.厂家试剂质量的变化造成
5.水质问题
6.加酶量过多（如 50uL误认为100uL）或丙肝酶稀释时加量过多
7.培养箱温度超过 37℃或酶结合物反应时间或底物显色时间超过
8.底物配制时间过长、或底物污染
9.该批样品放置时间过长，样品污染
10.移液嘴重复使用，未洗净或消毒不完全而用于加酶或底物
对策
1.CutOff值计算公式应严格参照所属产品的说明书，应注意各个酶免产品的Cutoff值计算公式不尽相同
2.严格按说明书要求洗板。调整洗板机时，应注意有时仪器标示的液量与实际液量并不相符，应根据实际情况调整至每孔注满
3.放置时间（自然放置 1~2h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意
4.国家标准要求提高灵敏度时，厂家试剂灵敏度也相应提高，假阳率常常有所上升，但只要在合理范围，是可以接受的
5.防止蒸馏水污染
6.加酶前检查移液器调节量是否准确，稀释酶时思想要集中。
7.放入板以前要检查培养箱的温度，准确定时
8.底物应在酶反应完毕即将洗涤前 5分钟配制，注意避光
9.样品应保持新鲜，或低温保存，防止污染
10.移液嘴尽可能一次性使用
重复性差
1.样品数量不一，加样时间长短不一
2.样品加入后未混匀
3.酶标仪滤光片不对或输入波长不对
4.酶标仪测定重复性差
5.洗涤不正确
6.温育条件不一致（一次用水育，一次用恒温箱）
7.慎多加或少加酶或显色剂
8.阈值附近时阴时阳
9.加样量不足、保温时间、洗涤条件一致
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