无菌室一般是在微生物实验室内专辟一个小房间，可以用板材和玻璃建造，面积不宜过大4～5m2即可，高2.5m左右；无菌室的设计可因地制宜，但应具备下列基本条件：室内的地面、墙壁须平整，不易藏污纳垢，便于清洗；要求严密、避光，隔板以用玻璃为佳，但为了在使用后排湿通风，应在顶部设立百叶排气窗，窗口加密封盖板，可以启闭，也可在窗口用数层纱布和棉花蒙罩，侧面底部应设进气孔，**能通入过滤的无菌空气。无菌室一般应有里外两间，较小的外间为缓冲间，以提高隔离效果，应安装拉门，以减少空气流动，必要时在向外一侧的玻璃隔板上安装一个双层的小型玻璃橱窗，便于内外传递物品，减少进出无菌室的次数。室外要设一个缓冲间，缓冲间的门和无菌室的门不要朝向同一方向，以免气流带进杂菌，无菌室和缓冲间都必须密闭。室内装备的换气设备须有空气过滤装置，室内应有照明、电热和动力用的电源；工作台台面应抗热、抗腐蚀，便于清洗消毒；可采用橡胶板或塑料板铺数台面，工作台的台面应该处于水平状态，无菌室和缓冲间都装有紫外线灯，和紫外线灯距离工作台面1m。无菌室应设有无菌操作间和缓冲间，操作间洁净度应达到10000级，室内温度保持在20～24℃，湿度保持在45%～60%，超净台洁净度应达到100级；无菌室应保持清洁，严禁堆放杂物，以防污染，严防一切灭菌器材和培养基污染，已污染者应停止使用；室内应备有工作浓度的消毒液。
应定期用适宜的灭菌清洁，以保证无菌室的洁净度符合要求，需要带入无菌室使用的仪器、器械、平皿等一切物品，均应包扎严密，并应经过适宜的方法灭菌。工作人员进入前，须用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在缓冲间更换专用的工作服、鞋、帽子、口罩和手套（或用70%的酒精再次擦拭双手），方可进入进行操作。无菌室使用前须打开紫外灯辐照灭菌30min以上，并且同时打开超净台进行吹风，操作完毕，应及时清理，再用紫外灯辐照灭菌20min。供试品在检查前，应保持外包装完整，不得开启，以防污染，检查前用70%的酒精棉球消毒外表面，每次操作过程中，均应做阴性对照，以检查无菌操作的可靠性。无菌室应每月检查菌落数，在超净工作台开启的状态下，取内径90mm的无菌培养皿若干，无菌操作分别注入融化并冷却至约45℃的营养琼脂培养基约15mL，放至凝固后，倒置于30～35℃培养箱培养48h，证明无菌后，取平板3～5个，分别放置工作位置的左中右等处，开盖暴露30min后，倒置于30～35℃培养箱培养48h，取出检查。100级洁净区平板杂菌数平均不得超过1个菌落，10000级洁净室平均不得超过3个菌落，如超过限度，应进行彻底消毒，直至重复检查合乎要求为止。
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