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体外培养细胞的各种生物特性会随着环境改变、传代次数增加而逐渐发生变化，因此及时进行细胞冻存对于维持细胞系的稳定性是十分必要的。细胞一般储存在-196℃的液氮罐里。细胞的冻存和复苏的基本原则是：“快冻快融”，以最大限度保存细胞活力。
1.细胞的冻存 细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，导致细胞局部电解质浓度增高，pH值改变，因此细胞部分蛋白质会发生变性，引起细胞内部空间结构紊乱。而细胞内各重要细胞器（如溶酶体、线粒体、细胞核等）膜结构遭到破坏引起功能的丧失最终导致细胞的死亡。因而在细胞冻存时要尽可能均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。目前多采用甘油或二甲基亚砜（DMSO）做保护剂，增大细胞各种膜结构对水的通透性，同时温度缓慢降低可以使细胞内水分渗出细胞外，在细胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。具体操作如下：
（1） 存活率最高的细胞是出于对数生长期的细胞，在冻存前1d换液。
（2） 按细胞传代方法，离心收集细胞，弃去旧培养基，将细胞重新悬浮于适量新鲜配置的细胞冻存液中（含有10%-20%血清，10%DMSO或甘油的完全培养基），使细胞密度为5×10^6-1×10^7个/ml，分装到无菌细胞冻存管中，每管1-1.5ml细胞悬液。
（3）冻存管口在酒精灯火焰稍做烧灼后封口，冻存管做好标记，标明细胞名称，并同时做好细胞系维持记录。
（4）冻存：冻存管先在-75℃ 的超级低温冰箱中冻存1d，第二天转移至液氮罐保存。
2.细胞的复苏 复苏细胞与冻存要求相反，应采用快速融化的手段，这样可以保证细胞外冰晶在很短时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成细胞内冰晶造成细胞损伤。
（1） 从液氮罐中取出冻存管直接投入37℃温水中，并不时摇动使其尽快融化。
（2）从37℃水浴中取出冻存管，按照无菌操作要求，在超净台内打开冻存管盖，将细胞悬浮转移至离心管中，添加10倍以上体积的新鲜培养液，低速离心，弃去上清，收集细胞，再重复用新鲜培养液洗细胞1次。
（3）细胞重新悬浮于新鲜培养液中，细胞密度以5×10^5个/ml为宜，接种至培养瓶。在CO2培养箱中进行培养。
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