细胞凋亡检测
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- 发布日期：2022/10/9 16:03:01
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详细说明
细胞凋亡检测细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA段化（细胞凋亡）的常用方法。
TUNEL实验中关键步骤：
1.充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60oC20min，再用使用二甲苯两次5-10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；
2.把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10-30min，几μm切片用短时间；几十μm切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3.适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37oC1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长2h，但要结合你终的背景着色。
4.DAB显色条件的选择。一般DAB反应10min左右，结合镜下控制背景颜色，长不超过30min；promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。
5.PBS的充分清洗。我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定后切片的非特异性着色。
6.此外，内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响终的特异性染色。
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